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    菌株及其鑒定與保存-細菌回復突變試驗(GB15193.4-2014)


    錄入時間:2015-1-29 10:29:53 來源:食品安全國家標準

    5.1  試驗菌株
        推薦采用下列的菌株組合
        a)  鼠傷寒沙門氏菌TAl535;
        b)  鼠傷寒沙門氏菌TA97a或TA97或TAl537;
        c)  鼠傷寒沙門氏菌TA98;
        d)  鼠傷寒沙門氏菌TAl00;
        e)  鼠傷寒沙門氏菌TAl02或大腸桿菌WP2uvrA或大腸桿菌WP2uvrA(PKMl01)。
    5.2菌株的鑒定
    5.2.1  總則
        菌株特性應與回復突變試驗標準相符。菌株的鑒定包括:基因型鑒定、白發回變數鑒定和對陽性致
    突變物敏感性的鑒定。
        每3個月進行一次菌株鑒定,遇到下列情況也應進行菌株鑒定:
        a)在收到培養菌株后;
        b)  當制備一套新的冷凍保存或冰凍干燥菌株時;
        c)重新挑選菌株時;
        d)使用主平板傳代時。
    5.2.2  鑒定方法
    5.2.2.1  增菌培養
        在5 mL營養肉湯培養基中用接種環接種貯存菌培養物,37℃振蕩(100次/min)培養10 h或靜置
    培養16 h,使活菌數不少于1×109/mL~2×109/mL。

    5.2.2.2組氨酸缺陷型(his)的鑒定
    5.2.2.2.1  底層培養皿的制備
        加熱融化底層培養基兩瓶。一瓶不加組氨酸,每100 mL底層培養基中加0.5mmol D-生物素
    0.6 mL;另一瓶加組氨酸,每100 mL底層培養基中加L-組氨酸l mL和O.5 mmol D-生物素0.6mL。
    冷卻至50℃左右,每種底層培養基各倒兩個平板。
    5.2.2.2.2  接種
        取有組氨酸和無組氨酸培養基平板各一個,按菌株號順序各取一接種環的菌液劃直線于培養基表
    面,37℃培養48 h。
    5.2.2.2.3  結果判定
        株菌在有組氨酸培養基平板表面各長出一條菌膜,在無組氨酸培養基平板上除白發回變菌落外無
    菌膜,說明受試菌株確為組氨酸缺陷型。

    5.2.2.3脂多糖屏障缺陷(rfa)的鑒定
    5.2.2.3.1  接種
        加熱融化營養肉湯瓊脂培養基。取菌液0.1mL移人平板,迅速將營養肉湯瓊脂培養基(冷卻至
    50℃左右)適量倒入平板,混勻,平放凝固。將無菌濾紙片一片放入已凝固的培養基平板中央,用移液
    器在濾紙片上滴加0.1%結晶紫溶液10μL,37℃培養24 h,每個菌株做一個平板。
    5.2.2.3.2  結果判定
        陽性者在紙片周圍出現一個透明的抑制帶,說明存在rfa突變。這種變化允許某些大分子物質進
    入細菌體內并抑制其生長。

    5.2.2.4 R因子(抗氨芐青霉素)的鑒定
    5.2.2.4.1  接種
        加熱融化營養肉湯瓊脂培養基,冷卻到50℃左右,適量倒入平板中,平放凝固,用移液器吸o.8%的
    氨芐青霉素10肛L,在凝固的培養基表面沿中線涂成一條帶,待氨芐青霉素溶液干后,用接種環取各菌
    株菌液與氨芐青霉素帶相交叉劃線接種,并且接種一個不具有R因子的菌株作氨芐青霉素抗性的對
    照,37℃培養24 h,一個平板可同時鑒定幾個菌株。
    5.2.2.4.2  結果判定
        菌株在氨芐青霉素帶的周圍依然生長不受抑制,即有抗氨芐青霉素效應,證明它們都帶有R因子。

    5.2.2.5  四環素抗性的鑒定
    5.2.2.5.1  接種
        用移液器各吸取5弘L~10肛L o.8%的四環素溶液和o.8%的氨芐青霉素溶液,在營養肉湯瓊脂培
    養基平板表面沿中線涂成一條帶,待四環素和氨芐青霉素溶液干后,用接種環取各菌株菌液與四環素和
    氨芐青霉素帶相交叉劃線接種TAl02和一種有R因子的菌株(作四環素抗性的對照),37℃培養24 h。
    5.2.2.5.2  結果判定
        TAl02菌株生長不受抑制,對照菌株有一段生長抑制區,表明TAl02菌株有抗四環素效應。

    5.2.2.6 uvrB修復缺陷型的鑒定
    5.2.2.6.1  接種
        在營養肉湯瓊脂培養基平板表面用接種環劃線接種需要的菌株。接種后的平板一半用墨紙覆蓋,
    在距15 W紫外線滅菌燈33 cm處照射8 s,37℃培養24 h。
    5.2.2.6.2  結果判定
        對紫外線敏感的三個菌株(TA97、TA98、TAl00)僅在沒有照射過的一半生長,具有野生型切除修
    復酶的菌株TAl02仍能生長。

    5.2.2.7  生物素缺陷型(bio)的鑒定
    5.2.2.7.1  底層培養皿的制備
        加熱融化底層培養基兩瓶。一瓶加生物素,每100 mL底層培養基中加0.5 mm01 D生物素O.6 mL
    和L組氨酸1 mL;另一瓶不加生物素,每100 mL底層培養基中加L組氨酸1 mL,冷卻至50℃左右,
    每種底層培養基各倒兩個平板。
    5.2.2.7.2  接種
        取有生物素和無生物素培養基平板各一個,按菌株號順序各取一接種環的菌液劃直線于培養基表
    面,37℃培養48 h。
    GB 151 93.4—201 4
    5.2.2.7.3  結果判定
        株菌在有生物素培養基平板表面各長m一條菌膜,在無生物素培養基平板上除白發回變菌落外無
    菌膜,說明受試菌株確為生物素缺陷型。
    5.2.2.8  自發回變率的測定
    5.2.2.8.1  測定方法
        準備底層培養基平板8個。融化頂層培養基8管,每管2 mL,在45℃水浴中保溫。在每管頂層培
    養基中,分別加入待鑒定的測試菌株的菌液o.1 mL,一式兩份,輕輕搖勻,迅速將此試管內容物倒人已
    固化的底層培養基平板中,轉動平板,使頂層培養基均勻分布,平放固化,37℃培養48 h,計數菌落數。
    5.2.2.8.2  結果判定
        每一株的自發回變率應落在表A.3所列的正常范圍內。
    5.3菌株的保存
        鑒定合格的菌株應保存在深低溫(如一80℃),或加人9%光譜級DMSO作為冷凍保護劑保存在液
    氮條件下(  196℃)。無上述條件者可冰凍干燥制成干粉,4℃保存。除液氮條件外,保存期一般不超
    過2年。主平板貯存于4℃,超過2個月后應丟棄(TAl02除外,保存2周后丟棄)。

     

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