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    食品安全國家標準-食品微生物學檢驗-乳酸菌檢驗

    GB 4789.35-2010 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗

    錄入時間:2010-4-28 9:02:54 來源:國家衛生部

    前 言
    本標準代替GB/T 4789.35-2008《食品衛生微生物學檢驗 食品中乳酸菌檢驗》。
    本標準與GB/T 4789.35-2008相比,主要變化如下:
    ——修改了乳酸菌總數、乳桿菌、雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌的計數方法。
    本標準的附錄A為規范性附錄。
    本標準所代替標準的歷次版本發布情況為:
    —— GB 4789.35-1996、GB/T 4789.35-2003、GB/T 4789.35-2008。

    1 范圍
    本標準規定了含乳酸菌食品中乳酸菌(lactic acid bacteria)的檢驗方法。
    本標準適用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的檢驗。

    2 規范性引用文件
    本標準中引用的文件對于本標準的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,僅所注日期的版本適用于本標準。凡是不注日

    期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本標準。

    3 術語和定義
    3.1 乳酸菌 lactic acid bacteria
    一類可發酵糖主要產生大量乳酸的細菌的通稱。本標準中乳酸菌主要為乳桿菌屬(Lactobacillus)、
    雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和鏈球菌屬(Streptococcus)。

    4 設備和材料
    除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下:
    4.1 恒溫培養箱:36℃±1℃。
    4.2 冰箱:2℃~5℃。
    4.3 均質器及無菌均質袋、均質杯或滅菌乳缽。
    4.4 天平:感量 0.1 g。
    4.5 無菌試管:18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。
    4.6 無菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸頭。
    4.7 無菌錐形瓶:500 mL、250 mL。

    5 培養基和試劑
    5.1 MRS(Man Rogosa Sharpe)培養基及莫匹羅星鋰鹽(Li-Mupirocin)改良 MRS 培養基:見附錄 A 中 A.1。
    5.2 MC 培養基(Modified Chalmers 培養基):見附錄 A 中 A.2。
    5.3 0.5 %蔗糖發酵管:見附錄 A 中 A.3。
    5.4 0.5 %纖維二糖發酵管:見附錄 A 中 A.3。
    5.5 0.5 %麥芽糖發酵管:見附錄 A 中 A.3。
    5.6 0.5 %甘露醇發酵管:見附錄 A 中 A.3。
    5.7 0.5 %水楊苷發酵管:見附錄A中A.3。
    5.8 0.5 %山梨醇發酵管:見附錄A中A.3。
    5.9 0.5 %乳糖發酵管:見附錄A中A.3。
    5.10 七葉苷發酵管:見附錄A中A.4。
    5.11 革蘭氏染色液:見附錄A中A.5。
    5.12 莫匹羅星鋰鹽(Li-Mupirocin):化學純。

    6 檢驗程序

    乳酸菌檢驗程序見圖1。
    乳酸菌檢驗程序

     

    7 操作步驟

    7.1 樣品制備

    7.1.1 樣品的全部制備過程均應遵循無菌操作程序。
    7.1.2 冷凍樣品可先使其在 2℃~5℃條件下解凍,時間不超過 18 h,也可在溫度不超過 45℃的條件,解凍時間不超過15min。
    7.1.3 固體和半固體食品:以無菌操作稱取 25 g 樣品,置于裝有 225 mL 生理鹽水的無菌均質杯內, 于 8000 r/min~10000 r/min 均質 1 min~2 min,制成 1:10 樣品勻液;或置于 225 mL 生理鹽水的無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打 1 min~2 min 制成 1:10 的樣品勻液。
    7.1.4 液體樣品:液體樣品應先將其充分搖勻后以無菌吸管吸取樣品 25 mL 放入裝有 225 mL 生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶
    內預置適當數量的無菌玻璃珠)中,充分振搖,制成 1:10 的樣品勻液。
    7.2 步驟
    7.2.1 用 1 mL 無菌吸管或微量移液器吸取 1:10 樣品勻液 1 mL,沿管壁緩慢注于裝有 9 mL 生理鹽水的無菌試管中(注意吸管尖端不要觸及稀釋液),振搖試管或換用1支無菌吸管反復吹打使其混合均勻,制成 1:100 的樣品勻液。
    7.2.2 另取 1 mL 無菌吸管或微量移液器吸頭,按上述操作順序,做 10 倍遞增樣品勻液,每遞增稀釋一次,即換用1次 1mL 滅菌吸管或吸頭。
    7.2.3 乳酸菌計數
    7.2.3.1 乳酸菌總數
    根據待檢樣品活菌總數的估計,選擇 2 個~3 個連續的適宜稀釋度,每個稀釋度吸取 0.1 mL 樣品勻液分別置于 2 個 MRS 瓊
    脂平板,使用 L 形棒進行表面涂布。36℃±1℃,厭氧培養 48 h±2 h 后計數平板上的所有菌落數。從樣品稀釋到平板涂布要
    求在 15min 內完成。
    7.2.3.2 雙歧桿菌計數
    根據對待檢樣品雙歧桿菌含量的估計,選擇 2 個~3 個連續的適宜稀釋度,每個稀釋度吸取 0.1 mL樣品勻液于莫匹羅星鋰鹽
    (Li-Mupirocin)改良 MRS 瓊脂平板,使用滅菌 L 形棒進行表面涂布,每個稀釋度作兩個平板。36℃±1℃,厭氧培養 48 h
    ±2 h 后計數平板上的所有菌落數。從樣品稀釋到平板涂布要求在 15 min 內完成。
    7.2.3.3 嗜熱鏈球菌計數
    根據待檢樣品嗜熱鏈球菌活菌數的估計,選擇 2 個~3 個連續的適宜稀釋度,每個稀釋度吸取 0.1 mL 樣品勻液分別置于 2
    個 MC 瓊脂平板,使用 L 形棒進行表面涂布。36℃±1℃,需氧培養 48 h±2 h 后計數。嗜熱鏈球菌在 MC 瓊脂平板上的菌
    落特征為:菌落中等偏小,邊緣整齊光滑的紅色菌落,直徑 2 mm±1 mm,菌落背面為粉紅色。從樣品稀釋到平板涂布要求在15 min 內完成。
    7.2.3.4 乳桿菌計數
    7.2.3.1 項乳酸菌總數結果減去7.2.3.2 項雙歧桿菌與7.2.3.3 項嗜熱鏈球菌計數結果之和即得乳桿菌計數。
    7.3 菌落計數
    可用肉眼觀察,必要時用放大鏡或菌落計數器,記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。菌落計數以菌落 形成單位(colony-forming units,CFU)表示。
    7.3.1 選取菌落數在 30 CFU~300 CFU 之間、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數。低于 30 CFU 的平板記錄具體菌落數,大于 300 CFU 的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數應采用兩個平板的平均數。
    7.3.2 其中一個平板有較大片狀菌落生長時,則不宜采用,而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數;若片狀菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均勻,即可計算半個平板后乘以 2,代表一個平板菌落數。
    7.3.3 當平板上出現菌落間無明顯界線的鏈狀生長時,則將每條單鏈作為一個菌落計數。
    7.4 結果的表述
    7.4.1 若只有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內,計算兩個平板菌落數的平均值,再將平均值乘以相應稀釋倍數,作為每 g(mL)中菌落總數結果。
    7.4.2 若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時,按公式(1)計算:

    計算公式

    式中:
    N——樣品中菌落數;
    C——平板(含適宜范圍菌落數的平板)菌落數之和;
    n 1——第一稀釋度(低稀釋倍數)平板個數;
    n 2——第二稀釋度(高稀釋倍數)平板個數;
    d——稀釋因子(第一稀釋度)。
    7.4.3 若所有稀釋度的平板上菌落數均大于 300 CFU,則對稀釋度最高的平板進行計數,其他平板可
    記錄為多不可計,結果按平均菌落數乘以最高稀釋倍數計算。
    7.4.4 若所有稀釋度的平板菌落數均小于 30 CFU,則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數計 算。
    7.4.5 若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小于 1 乘以最低稀釋倍數計算。
    7.4.6 若所有稀釋度的平板菌落數均不在 30 CFU~300 CFU 之間,其中一部分小于 30 CFU 或大于 300 CFU 時,則以最接近 30 CFU 或 300 CFU 的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。
    7.5 菌落數的報告
    7.5.1 菌落數小于 100 CFU 時,按"四舍五入"原則修約,以整數報告。
    7.5.2 菌落數大于或等于 100 CFU 時,第 3 位數字采用"四舍五入"原則修約后,取前 2 位數字,后 面用 0 代替位數;也可用 10 的指數形式來表示,按"四舍五入"原則修約后,采用兩位有效數字。
    7.5.3 稱重取樣以 CFU/g 為單位報告,體積取樣以 CFU/mL 為單位報告。
    8 結果與報告
    根據菌落計數結果出具報告,報告單位以CFU/g(mL)表示。
    9 乳酸菌的鑒定(可選做)
    9.1 純培養
    挑取 3 個或以上單個菌落,嗜熱鏈球菌接種于 MC 瓊脂平板,乳桿菌屬接種于 MRS 瓊脂平板,置
    36 ℃±1 ℃厭氧培養 48 h。
    9.2 鑒定
    9.2.1 雙歧桿菌的鑒定按 GB/T 4789.34 的規定操作。
    9.2.2 涂片鏡檢:乳桿菌屬菌體形態多樣,呈長桿狀、彎曲桿狀或短桿狀。無芽胞,革蘭氏染色陽性。 嗜熱鏈球菌菌體呈球形或球桿狀,直徑為 0.5m~2.0m,成對或成鏈排列,無芽胞,革蘭氏染色陽性。
    9.2.3 乳酸菌菌種主要生化反應見表 1 和表 2。

    乳酸菌菌種主要生化反應

    食品微生物學檢驗2010標準
    食品微生物學檢驗2010標準(GB 4789)已于2010年3月正式頒布并于2010-06-01開始實施.
    詳細請看:
    GB 4789-2010檢驗標準
    GB 4789-2010培養基目錄
    食品微生物學檢驗2010標準
    GB 4789.1-2010 總則
    GB 4789.2-2010 菌落總數測定
    GB 4789.3-2010 大腸菌群計數
    GB 4789.4-2010 沙門氏菌檢驗
    GB 4789.10-2010 金黃色葡萄球菌檢驗
    GB 4789.15-2010 霉菌和酵母計數
    GB 4789.18-2010 乳與乳制品檢驗
    GB 4789.30-2010 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗
    GB 4789.35-2010 乳酸菌檢驗
    GB 4789.40-2010 阪崎腸桿菌檢驗
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